Calcolo del DNA a doppio filamento in ng/µL da A260

Applica il fattore convenzionale: una A260 pari a 1.0 corrisponde a 50 ng/µL con un cammino ottico di 1 cm. Inserisca la A260 osservata e il fattore di diluizione totale per stimare la concentrazione del campione originale. Il calcolo è deterministico, trasparente e adatto alle comuni procedure di quantificazione degli acidi nucleici.

Inserisca la lettura effettivamente misurata dallo strumento

Utilizzi l’assorbanza rilevata a 260 nm per l’aliquota collocata nello spettrofotometro o nello strumento per microvolumi. Il calcolatore richiede un valore numerico non negativo e presume che la lettura sia equivalente a un cammino ottico di 1 cm, cioè la convenzione alla base del fattore standard per il DNA a doppio filamento. Molti strumenti per microvolumi normalizzano già l’assorbanza visualizzata rispetto a tale cammino; in caso di dubbio, verifichi il referto o il metodo dello strumento. Non inserisca una concentrazione calcolata dallo strumento, perché questo calcolo parte dall’assorbanza. Se il campione non è stato diluito, lasci il fattore a 1. È preferibile una lettura corretta con il bianco, poiché l’assorbanza del tampone, della cuvetta o della superficie di misura può aumentare la stima. Le letture negative vengono rifiutate invece di essere trasformate in una concentrazione negativa priva di significato fisico. Il risultato descrive la concentrazione in massa implicata dalla A260, ma non conferma che tutto il materiale assorbente sia DNA integro a doppio filamento.

Applichi una sola volta il fattore di diluizione complessivo

Il fattore di diluizione ricostruisce la concentrazione del campione originale a partire dall’aliquota diluita sottoposta a misura. Se una parte di campione viene aggiunta a nove parti di diluente, il volume totale è di dieci parti e deve inserire 10. Per una diluizione 1:20, inserisca 20. Se sono stati eseguiti più passaggi, moltiplichi i relativi fattori prima di immettere il valore: una diluizione di dieci volte seguita da una di cinque volte produce un fattore totale di 50. Il calcolatore moltiplica la A260 osservata per 50 ng/µL per unità di assorbanza e poi per il fattore totale. Eviti di applicare due volte la correzione. Se il software dello strumento ha già corretto l’assorbanza visualizzata per la diluizione, usi 1; se mostra la lettura grezza dell’aliquota diluita, usi il fattore totale effettivo. Registrare la diluizione insieme al risultato rende il calcolo riproducibile e distingue un’assorbanza misurata bassa da una bassa concentrazione nella provetta iniziale.

Interpreti la stima nel suo contesto biochimico

La concentrazione restituita segue la relazione convenzionale per il DNA a doppio filamento: la concentrazione in ng/µL equivale alla A260 moltiplicata per 50 e per il fattore di diluizione. La relazione è pratica perché 1 ng/µL è numericamente uguale a 1 µg/mL, quindi non occorre un’ulteriore conversione. Tuttavia, l’assorbanza non è selettiva per il DNA a doppio filamento. RNA, acidi nucleici a filamento singolo, nucleotidi liberi, fenolo e altri composti possono contribuire all’assorbanza intorno a 260 nm. I rapporti di purezza A260/A280 e A260/A230, un bianco adeguato e un saggio fluorescente specifico per il DNA a doppio filamento possono essere importanti quando servono selettività o accuratezza a basse concentrazioni. Il calcolatore non valuta frammentazione, amplificabilità o integrità biologica. Consideri il risultato come una stima della concentrazione in massa derivata dalla A260 secondo la convenzione di 1 cm. Per le reazioni successive, lo confronti con i requisiti del saggio, la purezza prevista e l’intervallo di accuratezza dello strumento, senza affidarsi soltanto al numero calcolato.