dsDNA-Konzentration in ng/µL aus A260 berechnen

Er verwendet den üblichen Faktor: Bei einer optischen Weglänge von 1 cm entspricht eine A260 von 1.0 einer Konzentration von 50 ng/µL. Geben Sie die gemessene A260 und den gesamten Verdünnungsfaktor ein, um die geschätzte Konzentration der ursprünglichen Probe zu erhalten. Die Berechnung ist deterministisch, nachvollziehbar und für routinemäßige Nukleinsäurebestimmungen geeignet.

Geben Sie den tatsächlich gemessenen Wert ein

Verwenden Sie die bei 260 nm angezeigte Absorbanz der Aliquote, die sich im Spektralphotometer oder Mikrovolumenmessgerät befand. Der Rechner erwartet einen nicht negativen Zahlenwert und setzt voraus, dass die Messung einer optischen Weglänge von 1 cm entspricht. Auf dieser Konvention beruht der übliche Umrechnungsfaktor für doppelsträngige DNA. Viele Mikrovolumengeräte normieren die angezeigte Absorbanz bereits auf diese Weglänge; prüfen Sie im Zweifel die Ausgabe oder die Messmethode Ihres Geräts. Geben Sie keine vom Gerät berechnete Konzentration ein, denn dieser Rechner beginnt mit der Absorbanz selbst. Wurde die Probe unverdünnt gemessen, lassen Sie den Verdünnungsfaktor auf 1. Eine mit einem Leerwert korrigierte Messung ist vorzuziehen, da Puffer, Küvette oder Messoberfläche die Schätzung sonst erhöhen können. Negative Messwerte werden abgelehnt und nicht in eine physikalisch irreführende negative Konzentration umgerechnet. Das Ergebnis beschreibt die aus A260 abgeleitete Massenkonzentration; es bestätigt nicht unabhängig, dass das gesamte absorbierende Material intakte doppelsträngige DNA ist.

Wenden Sie den gesamten Verdünnungsfaktor einmal an

Mit dem Verdünnungsfaktor wird aus der gemessenen verdünnten Aliquote die Konzentration der ursprünglichen Probe zurückgerechnet. Bei einem Teil Probe und neun Teilen Verdünnungsmittel besteht das Gesamtvolumen aus zehn Teilen; geben Sie deshalb 10 ein. Für eine Verdünnung von 1:20 geben Sie 20 ein. Wurden mehrere Verdünnungsschritte durchgeführt, multiplizieren Sie deren Faktoren vor der Eingabe: Auf eine zehnfache Verdünnung und eine anschließende fünffache Verdünnung entfällt insgesamt der Faktor 50. Der Rechner multipliziert die beobachtete A260 mit 50 ng/µL je Absorbanzeinheit und anschließend mit diesem Gesamtfaktor. Vermeiden Sie eine doppelte Korrektur. Hat die Gerätesoftware die angezeigte Absorbanz bereits um die Verdünnung korrigiert, verwenden Sie 1; zeigt sie den Rohwert der verdünnten Aliquote, verwenden Sie den tatsächlichen Gesamtfaktor. Wenn Sie die Verdünnung zusammen mit dem Ergebnis festhalten, bleibt die Berechnung reproduzierbar und eine niedrige gemessene Absorbanz lässt sich von einer niedrigen Konzentration im Ausgangsgefäß unterscheiden.

Ordnen Sie die Schätzung biochemisch richtig ein

Die ausgegebene Konzentration folgt der üblichen Beziehung für doppelsträngige DNA: Die Konzentration in ng/µL ist A260 multipliziert mit 50 und dem Verdünnungsfaktor. Diese Beziehung ist praktisch, weil 1 ng/µL zahlenmäßig 1 µg/mL entspricht und keine weitere Einheitenumrechnung erforderlich ist. Die Absorbanz ist jedoch nicht selektiv für doppelsträngige DNA. RNA, einzelsträngige Nukleinsäuren, freie Nukleotide, Phenol und andere Verbindungen können bei oder nahe 260 nm ebenfalls absorbieren. Reinheitsquotienten wie A260/A280 und A260/A230, ein geeigneter Leerwert sowie ein fluoreszenzbasiertes dsDNA-spezifisches Verfahren können wichtig sein, wenn Selektivität oder Genauigkeit bei geringen Konzentrationen benötigt werden. Der Rechner beurteilt außerdem weder Fragmentierung noch Amplifizierbarkeit oder biologische Integrität. Betrachten Sie die Ausgabe als eine aus A260 abgeleitete Schätzung der Massenkonzentration unter der 1-cm-Konvention. Stimmen Sie sie für nachfolgende Reaktionen mit den Anforderungen des Verfahrens, der erwarteten Reinheit und dem praktischen Genauigkeitsbereich des Messgeräts ab, statt sich allein auf den berechneten Zahlenwert zu verlassen.